بررسی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR در بافت کبد موش های نرمال و چاق- قسمت ۳

بررسی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR در بافت کبد موش های نرمال و چاق- قسمت ۳

استفاده شده در PCR ۴۶
شکل۳-۵-اتصال SYBR به DNA ۵۲
شکل۴-۱-تصویر باند حاصل از RNA استخراج شده ۶۷
شکل۴-۲-صویر محصولات PCR چند نمونه که به صورت تصادفی انتخاب شده بودند ۶۸
فهرست اختصارات
VLN under limit normal
LTR long terminal repeat
NTE non translated exon
EGCG (-)-epigallocatechin-3-gallat
OD optical density
NTC no template control
PCR polymerase chain reaction
FRET fluorescence resonance energy transfer
CT cycle threshold
Tm melting temperature
HPRT hypoxanthine quinine phosphoribosyl transferase
WHO world health organization

 

چکیده:

 

مقدمه و اهداف
آلفا آمیلاز آنزیمی از راسته هیدرولازها است که پیوندهای ۱به۴ آلفا گلیکوزیدی در پلی ساکاریدها را کاتالیز می کند و یکی از مهمترین آنزیم های گوارشی است. استفاده از مهارکننده های آلفا آمیلاز (مانند چای سبز) می تواند در کنترل وزن مفید باشد، بنابراین مقایسه میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی بین موش های چاق و نرمال و تاثیر مهار کننده های آنزیم در میزان بیان ژن می تواند به مطالعات درمانی چاقی و سندرم متابولیک کمک نماید.
مواد و روش ها
موش ماده NMRI (6 هفته ای) به طور تصادفی به ۴ گروه (۸=n)تقسیم شدند. گروه اول موش های نرمال بودند که تحت هیچ تیماری قرار نگرفته بودند. گروه دوم موش های نرمال بودند که عصاره ی آبی الکلی چای سبز (به میزان ۲/۰ میلی گرم) مصرف کرده بودند. گروه سوم موش هایی بودند که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند وگروه چهارم موش هایی بودند که علاوه بر این که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند در این مدت از عصاره ی آبی الکلی چای سبز هم (به میزان ۲/۰ میلی گرم) دریافت کرده بودند. طی ۸ هفته، در ۴ گروه وزن بدن به صورت هفتگی اندازه گیری شدو پس از پایان دوره بافت کبدی جدا شده و بیان آلفا آمیلاز کبدی اندازه گیری شد. پس ازجداسازی RNA و سنتزcDNA،Real time -PCR با پرایمر اختصاصی برای ژن Amy-1 ژن انجام شد.
نتایج
متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی در مقایسه با موش های کنترل عادی افزایش یافته، و این افزایش از لحاظ آماری معنی دار است (P value≤۰٫۰۱).همچنین متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق تیمار در مقایسه موش های چاق عادی کاهش یافته، واین کاهش هم از لحاظ آماری معنی دار است ( P value≤۰٫۰۴). لذا می توان گفت مصرف هم زمان چای سبز با رژیم غذایی پر کالری اثر کاهنده بر روند افزایش بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی دارد.
واژه گان کلیدی : آلفا آمیلاز، کبد، بیان ژن، چاقی،چای سبز
فصل اول: کلیات
۱-۱-بیان مسئله
چاقی به عنوان یک خطر بزرگ برای سلامت انسان شناخته می شود. چاقی می تواند خطر ابتلا به بیماری های قلبی و عروقی (به طور عمده بیماری قلبی و سکته مغزی)، دیابت نوع ۲، اختلالات اسکلتی عضلانی (به خصوص آرتروز) و انواع خاصی از سرطان (آندومتر، PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است) و روده بزرگ) را افزایش دهد (۷۴).
عموما کربوهیدرات ها یکی از اجزای اصلی تشکیل دهنده رژیم غذایی می باشند . کربوهیدرات ها قبل از اینکه توسط بدن جذب شوند باید به مونوساکاریدها شکسته شده باشند. این تجزیه با بهره گرفتن از دو آنزیم رخ می دهد: آمیلاز و گلوکوزیداز(۵۵).
بنابر این جستجو برای یافتن مهار کننده قوی و کاربردی آلفا گلوکوزیداز و آلفا آمیلاز به عنوان ابزاری برای درمان چاقی مطرح شده و در حال حاضر تبدیل به کانونی برای پژوهش گردیده است.تا به حال مهار کننده های مختلفی برای آلفا آمیلاز شناسایی شده است که از آنها می توان به فلاونوئید ها اشاره کرد که از جمله آنها می توان به کاتچین ها اشاره کرد. کاتچین ماده موثره چای سبز می باشد (۶۵). لذا احتمال دارد چای سبز نقش مهاری برای بیان ژن آلفا آمیلاز داشته باشد.
در این تحقیق قصد بر آن بوده است که از عصاره ی چای سبز به عنوان مهارکننده بالقوه بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش ها استفاده شود. استفاده از مهارکننده های آلفا آمیلاز(چای سبز) می تواند در کنترل وزن مفید باشد، بنابراین مقایسه میزان بیان ژن آلفا آمیلازکبدی بین موش های چاق و نرمال و تاثیر مهار کننده های آنزیم در میزان بیان ژن می تواند به مطالعات درمانی چاقی و سندرم متابولیک کمک نماید.
۱-۲-اهداف پژوهش

 

جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت jemo.ir مراجعه نمایید.

 

 

 

  •  
    • بررسی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR در بافت کبد موش های نرمال و چاق

 

– بررسی اثر چای سبز بر روند چاقی موش های چاق و نرمال
۱-۳-فرضیات اصلی پژوهش
– عصاره ی چای سبز اثر بازدارنده بر روند چاقی موش های چاق دارد.
– بیان ژن آلفا آمیلاز در کبد موش های چاق بیشتر از موش های نرمال است.
– بیان ژن آلفا آمیلاز در کبد موش های چاق تیمار شده با چای سبز نسبت به موش های چاق غیر تیمار کمتر است.
– بیان ژن آلفا آمیلاز در کبد موش های نرمال تیمار شده با چای سبز نسبت به موش های نرمال غیر تیمار کمتر است.
۱-۴- جنبه جدید بودن و نوآوری در تحقیق:
در کلیه مقالات مطالعه شده اثر چای سبز بر روی فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفته است در صورتی که قصد این پژوهش مطالعه اثر عصاره ی آبی و متانولی چای سبز بر بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR در موش چاق و نرمال است.
فصل دوم: مروری بر مطالعات گذشته

 

۲-۱-آمیلاز:

 

آمیلاز آنزیمی است که باعث تجزیه نشاسته به قند می باشد. آمیلاز موجود در بزاق انسان اولین فرایند شیمیایی هضم را آغاز میکند. غذاهایی که حاوی مقادیر بالایی نشاسته اما قند بسیار کم هستند مانند برنج و سیب زمینی، هنگام جویده شدن در دهان، کمی طعم شیرین دارند زیرا آمیلاز در دهان نشاسته را به قند تبدیل می کند. همچنین آمیلاز موجود در پانکراس باعث می شود نشاسته موجود در رژیم غذایی به دی ساکارید ها و تری ساکاریدهای هیدرولیز شوند که توسط آنزیم های دیگر برای تامین انرژی بدن به گلوکز تبدیل می شود. گیاهان و برخی از باکتری ها نیز آمیلاز تولید می کنند (۲۶).

 

۲-۱-۱- تاریخچه:

 

لاچس در سال ۱۸۳۱، هیدرولیز نشاسته به آمیلاز را در بزاق به علت وجود آنزیمی در بزاق به نام ptyalin یا ماده تخمیری بزاق شرح داد (۳۸). پایان و پرسوز شیمیدانان فرانسه در سال ۱۸۳۳ مجموعه آمیلاز را از جوانه جو جدا کردند و آن را “دیاستاز” نامیدند(۵۳) و در سال ۱۸۶۲، جکولوویتچ آمیلاز پانکراس را شناسایی کرد (۱۴).

 

۲-۱-۲- آمیلاز در تکامل دستگاه گوارش انسان:

 

کربوهیدرات ها منبع غذایی غنی انرژی هستند. آمیلاز یک نقش کلیدی در تکامل دستگاه گوارش انسان داشته است چرا که امکان استفاده از یک جایگزین برای میوه و پروتئین را به انسان داده است. کپی برداری از ژن آمیلاز پانکراس به طور مستقل در انسان و جوندگان توسعه یافته است، که اهمیت بالای این آنزیم را نشان می دهد. سطح آمیلاز بزاقی که در تبار انسان یافت می شوند، شش تا هشت برابر بیشتر از شامپانزه است، که عمدتا میوه خوارند ونسبت به انسان کمتر مواد نشاسته ای مصرف می کنند(۷۲).

 

۲-۱-۳-  کارکردهای آمیلاز :

 

آمیلاز موجب شکستن قندهای پیچیده از قبیل نشاسته موجود در آرد به قندهای ساده می شود. مخمر ها سپس بر روی این قندهای ساده واکنش انجام می دهند و آن را به الکل و CO2 تبدیل می کنند. این محصولات باعث افزایش عطر و طعم نان نسبت به برنج می شوند. در حالی که آمیلاز به طور طبیعی در سلول های مخمر یافت می شود، زمانی طول می کشد تا مخمر به میزان کافی از این آنزیم برای شکستن مقادیر قابل توجهی از نشاسته در نان ، تولید کند. یکی ازدلایل برای استفاده خمیر ترش در پخت نان همین موضوع است. درتکنیک های مدرن تولید نان از آمیلاز (که اغلب به صورت جو مالت شده است) به عنوان بهبود دهنده نان استفاده می کنند، تا فرایند پخت نان برای استفاده تجاری سریع تر و عملی تر شود(۴۴).
زمانی که آمیلاز به عنوان یک افزودنی غذایی استفاده می شود،) آمیلاز شماره (E1100، ممکن است از لوزالمعده خوکی یا قارچ مشتق شده باشد. آمیلاز باکتریایی [۱] نیز درپودر لباس شویی و مواد شوینده ماشین ظرفشویی برای انحلال نشاسته از پارچه و ظروف استفاده می شود.
کارگران کارخانه که با آمیلاز برای هر یک از کاربردهای فوق کار می کنند، در معرض افزایش خطر ابتلا به آسم شغلی هستند. ۵ تا ۹ درصد نانوا ها تست پوستی مثبت درمورد آمیلاز دارند ، و یک سوم تا یک چهارم مشکلات تنفسی نانواها به خاطر حساسیت به آمیلاز است (۴۳).
یکی از مهار کننده های آلفا آمیلاز به نام فاسئولامین[۲]، به عنوان یک کمک کننده بالقوه در رژیم غذایی یافت شده است (۶۹).
آمیلاز سرم خون ممکن است برای مقاصد تشخیص طبی اندازه گیری شود. غلظت طبیعی آن در محدوده (U/L101-21) است. وجود آمیلاز بالاتر از غلظت نرمال ممکن است منعکس کننده بیماری هایی نظیر التهاب حاد پانکراس (اگرهمزمان با لیپاز باشد مشخص تر است)(۱۸)، زخم معده حاد، کیست تخمدان، انسداد روده کوچک و اوریون باشد. آمیلاز ممکن است در سایر مایعات بدن، از جمله ادرار و مایع صفاقی اندازه گیری شود(۹).
در زیست شناسی مولکولی، حضور آمیلاز می تواند به عنوان یک روش کمکی دیگری برای انتخاب یکپارچه سازی موفق از سازه گزارشگر علاوه بر مقاومت به آنتی بیوتیک استفاده شود مناطق همولوگ از ژن ساختاری آمیلاز به عنوان ژن گزارشگر عمل می نمایند ،در صورت موفق بودن ادغام ژن مورد نظر ؛ ژن آلفا آمیلاز تخریب شده و از تجزیه نشاسته جلوگیری می شود که این امر به راحتی از طریق رنگ آمیزی ید قابل تشخیص است(۹).
آمیلاز در بدن انسان در بزاق، آنزیمهای لوزالمعده و روده باریک یافت می شود. این آنزیم باعث تجزیه زنجیره های پلی ساکارید مانند نشاسته به اجزای کوچکتر و دی ساکاریدهایی مانند مالتوز می شود و نقش مهمی در هضم کربوهیدراتها دارد.سایر بافتها نیز تا حدودی فعالیت آمیلازی دارند که در این باره می توان به اندام هایی چون تخمدان ها ، روده کوچک و بزرگ و عضلات مخطط اشاره کرد(۹).
آلفا آمیلاز موجود در بزاق کمی از نشاسته را تجزیه می کند چون مدت توقف غذا در دهان ناچیز است ولی قسمت عمده فعالیت این آنزیم مربوط به آمیلاز پانکراس است. آمیلاز به طورطبیعی از سلول های آسینار پانکراس به مجرای پانکراس وسپس دوازدهه ترشح می گردد و در روده به تجزیه نشاسته کمک می کند (۹).
هضم نشاسته طی مراحل مختلفی در انسان انجام می شود. در ابتدا آلفاآمیلازهای بزاقی یک هضم جزئی انجام می دهند، که سبب شکستن نشاسته پلی مریک به الیگومرهای کوچکتر می شود. به محض اینکه این نشاسته کمی هضم شده به روده می رسد، توسط آلفاآمیلاز پانکراسی بطور گسترده ای به الیگوساکاریدهای کوچکتر هضم شده، به درون لومن ترشح می شود. مخلوط حاصل، از الیگوساکاریدها حاوی مالتوز، مالتوتریوز و تعدادی الیگو- گلوکانهای آلفا ۱به۴ و آلفا ۱به۶ می باشد. سپس این مخلوط از خلال لایه موکوسی به غشای پوشیده از میکروویلی سلولهای روده می رسد. در این نقطه تعدادی از آلفاگلوکوزیدازها تجزیه بیشتر این الیگوساکاریدها را تا به دست آمدن گلوکوز انجام خواهند داد. سپس این گلوکوز جذب شده، با یک سیستم انتقالی خاص وارد جریان خون می شود(۶۱).

 

۲-۱-۴- ساختار آمیلاز:

 

آمیلازها ساختاری پروتئینی دارند و به سه زیر گروه آلفا آمیلاز (α-Amylase) ، بتا آمیلاز (β-Amylase) و گاما آمیلاز (γ-Amylase) تقسیم بندی می شوند. عمل هیدرولیز آلفا آمیلاز مرتب نبوده و در قسمت های مختلف زنجیره اثر می کند و بتا آمیلاز زنجیره های پلی ساکاریدی مانند نشاسته و گلیکوژن را از قسمت انتهایی احیا کننده ی آنها هیدرولیز می کند و هربار یک مولکول مالتوز به وجود می آورد و
گاما آمیلاز هم در واقع شبیه آلفا آمیلاز است ولی از نوع لیزوزمی آن که تفاوت اصلی آن با دو نوع دیگر آمیلاز کارآمدی آن در محیط های اسیدی است. دو ایزوآنزیم عمده آمیلاز مربوط به پانکراس (p) وغدد بزاقی (s) است. pH مطلوب برای این آنزیم حدود ۷ می باشد .یون های کلر، برم و نیترات آن را فعال وسیترات و اگزالات آن را مهار می کنند. در واقع آنزیم آمیلاز نشاسته رااز محل پیوندهای ۱به۴ هیدرولیز می کند. آن را به مالتوز تبدیل می کند(۹).

 

۲-۱-۵- اندازه گیری سطح خونی:

 

سطح خونی این آنزیم در آسیب سلولهای پانکراس در بیماری پانکراتیت و سایر بیماری های پانکراس مانند انسداد مجاری پانکراس در خون افزایش می یابد. بنابراین در موارد وجود علائم مربوط به بیماریهای پانکراس مانند درد شدید شکمی، تب، کاهش اشتها و استفراغ این تست درخواست می شود(۹).

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

*